EPHAI

Diverses approches sont développées afin : (i) de progresser dans la connaissance de la structure des populations des agents parasitaires ou bactériens pour mieux appréhender la transmission de la maladie et le fonctionnement des foyers; (ii) d'identifier des facteurs parasitaires ou des hôtes susceptibles de jouer un rôle direct ou indirect dans l'expression de la maladie chez l'homme. Nous développons également des études d'évolution expérimentale qui sont des sources d'informations indispensables pour appréhender certains traits d'histoire de vie des pathogènes tels que le potentiel de résistance, l'avantage sélectif ou les phénomènes de compétition intra ou inter spécifiques.

Cette partie est directement liée au premier volet de ce projet dans le sens où la plupart des thèmes de recherche détaillés ci-dessous, seront basés sur les données épidémiologiques et cliniques et les échantillons obtenus dans les études de terrain.

Structure des populations et mode de reproduction des pathogènes à l'étude : Leishmania, S. aureus et M. tuberculosis.

L'exploration de la structure génétique des populations naturelles apparaît comme incontournable pour l'étude des microorganismes et en particulier pour ceux d'intérêt médical ou vétérinaire. En effet, les observations directes sont impossibles et les approches expérimentales ne permettent pas en général d'inférer sur la structure génétique de ces organismes dans les populations naturelles. La connaissance de la biologie des populations de tels organismes est un pré-requis pour la compréhension de l'épidémiologie des maladies qu'ils entraînent et pour l'élaboration de stratégies de lutte plus efficaces. Malgré l'augmentation du nombre de travaux dans ce domaine beaucoup reste à explorer quant à la structure génétique de ces organismes, leur mode de dispersion, l'origine des infections, leur répartition spatiale et temporelle. Pour chacun des modèles, il sera également étudié s'il existe un lien entre la structure de la population (distribution allélique ou génotypique) et le tropisme chez l'homme. Ce volet est réalisé en collaboration avec des spécialistes en génétique des populations appartenant aux autres équipes du laboratoire.

Modèle Leishmania

De nombreuses études ont suggéré, voire admis, l'existence d'une structure des populations de Leishmania strictement clonale, avec des phénomènes de recombinaison occasionnelle. Cependant, certaines critiques peuvent être faites sur les analyses de génétique des populations réalisées jusqu'à présent sur les Leishmania. Tout d'abord ces travaux se basent principalement sur l'exploitation de résultats issus de données isoenzymatiques, RAPD (Random Amplified of polymorphic DNA) ou encore de données PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis). Ces techniques soit ne sont pas assez résolutives (faible niveau de polymorphisme), soit ne donnent aucune information sur la distribution de l'information génétique en terme de fréquence allélique entre et au sein des populations. Ces marqueurs ne semblent donc pas être les plus adaptés aux études de génétique des populations. D'autre part, ces analyses s'appuient principalement sur le déséquilibre de liaison. Cependant, certains auteurs ont démontré qu'aucun estimateur de déséquilibre de liaison disponible dans les logiciels de génétique des populations n'était capable de mesurer de manière précise la proportion de reproduction sexuée ou clonale dans une population. Pour finir, il apparaît que certains résultats sont en contradiction avec une structure strictement clonale, tels que de faibles taux de locus hétérozygotes et une structure génétique non strictement distribuée en lignées individualisées au niveau intraspécifique. Une étude préliminaire de génétique des populations a été réalisée sur 2 échantillons de Leishmania braziliensis par Virginie Rougeron au cours de son stage de master 2 BIMP (obtenu en juin 2006). Ces premières analyses ont révélé des résultats en contradiction avec un mode de reproduction clonal classique. En effet, les analyses ont suggéré que les Leishmania suivent un régime de reproduction autofécondant. Cette conclusion s'est basée principalement sur l'existence de forts déficits en hétérozygotes associés à de forts déséquilibres de liaison. De plus, la diminution mais la conservation d'un fort déficit en hétérozygotes dans les sous-populations montrent qu'il existe un effet Wahlund (conséquence directe de la présence de subdivisions à l'intérieur de la population) mais qu'il ne peut expliquer complètement ces résultats. De plus, cette étude montre qu'il est fondamental de faire des analyses au niveau de micro-foyers pour valider l'hypothèse d'autofécondation.

L'étude sur les Leishmania est réalisée par Virginie Rougeron, étudiante en thèse depuis le 1er octobre 2006 (bourse MRT) dans le cadre du projet IAEL financé par l'ANR (voir plus haut, partie I.1.3.). Le but principal de sa thèse est l'étude de l'impact de l'anthropisation et de l'environnement sur la structure des populations des Leishmania. Cette thèse est co-encadrée par Thierry De Meeûs (SGASS), Anne-Laure Bañuls et Mallorie Hide.

Modèle Mycobacterium tuberculosis

Les mycobactéries comme la plupart des bactéries auraient la potentialité d'échanger de l'ADN. En effet, des transductions expérimentales ont été réalisées chez M. tuberculosis, et des conjugaisons naturelles ont été mises en évidence chez M. smegmatis. Certains auteurs ont également démontré que des mycobactéries non tuberculeuses ont la capacité d'acquérir des gènes de résistance aux antibiotiques provenant d'autres espèces. Il faut noter également que des infections par deux souches différentes de M. tuberculosis ont été décrites chez l'homme dans des zones de forte incidence. Toutes ces données suggèrent que M. tuberculosis possède le potentiel nécessaire pour échanger de l'ADN en populations naturelles. Avec le développement de marqueurs minisatellites (MIRU-VNTR) dans les années 2000, 2 études de génétique des populations portant sur des échantillons marocains et d'Afrique du sud ont suggéré une structure des populations clonale sans évidence d'échanges génétiques entre les souches. Cependant, une étude phylogénétique récente portant sur un échantillon de souches de Djibouti dans lequel était inclus M. canettii (espèce du complexe M. tuberculosis), appelé par les auteurs M. prototuberculosis, suggère des événements de recombinaison fréquents dans cette population. La même analyse réalisée au sein du complexe M. tuberculosis ne détecte aucun événement de recombinaison, en accord avec la structure clonale précédemment décrite. D'après toutes ces données et les phylogénies construites, les auteurs font l'hypothèse que M. prototuberculosis représente la population ancestrale de laquelle découleraient, à la suite d'un goulot d'étranglement, tous les membres du complexe M. tuberculosis. Pour expliquer l'absence apparente d'événements de recombinaisons dans le complexe M. tuberculosis (échanges génétiques fréquents/structure clonale), les auteurs proposent plusieurs hypothèses : la progénie a perdu la capacité de réaliser des transferts de gènes horizontaux après le goulot d'étranglement; les transferts de gènes horizontaux sont relativement rares et n'ont pas pu avoir lieu depuis le goulot d'étranglement; la niche écologique des membres du complexe M. tuberculosis diffère de celle de M. prototuberculosis et n'offre pas d'opportunité pour les événements de recombinaison. Ces données et le peu d'études montrent que beaucoup reste à faire dans ce domaine. Afin de mieux appréhender l'épidémiologie de la tuberculose et de comprendre la transmission à un niveau global, il est fondamental d'étudier la structure des populations de M. tuberculosis dans diverses aires géographiques présentant des niveaux d'incidences ou un historique de tuberculose variés. En effet, l'étude de la structure des populations dans le modèle Mycobacterium tuberculosis est développée dans des pays d'incidence variable de la tuberculose: Djibouti (la plus forte incidence au niveau mondial), le Burkina Faso (incidence élevée) et Montpellier et sa région (faible incidence). les premières analyses réalisées par Sylvain Godreuil au cours de sa thèse, portant sur le Burkina Faso et Djibouti et sur Montpellier et sa région (voir plus haut), ont montré des structures de populations spécifiques. Il faut noter que ces pays présentent des histoires de tuberculose, des niveaux de prise en charge de la maladie et des incidences très différentes. Il est donc pertinent et important de poursuivre ces études avec des outils statistiques et des échantillons adaptés à des études de génétique des populations. L'étude à Djibouti est d'autant plus intéressante que ce pays est décrit comme le berceau de la tuberculose et M. prototuberculosis (voir ci-dessus) a été identifiée jusqu'à présent uniquement dans cette zone de l'Afrique. Pour développer cette étude, la collaboration avec le Burkina Faso et le CHU de Montpellier continuera pour l'analyse épidémiologique et génétique (voir partie I.2). Un autre échantillon français (banque de plus de 1000 souches) va être mis à notre disposition par le laboratoire privé Marcel Merieux de Lyon. Pour Djibouti, Sylvain Godreuil est en contact avec les Drs Depina et Garnotel du laboratoire de Microbiologie de l'hôpital d'Instruction des Armées de Laveran à Marseille pour mettre en place une étude dans ce pays. Ce projet est développé par Sylvain Godreuil et Anne-Laure Bañuls.

Modèle Staphylococcus aureus

Cette bactérie est un modèle très informatif du fait de sa transmission au niveau nosocomial pour plusieurs raisons : (i) lors d'une épidémie elle évolue en milieu relativement clos, ce qui présente un échantillon d'étude presque parfait pour des études de génétique des populations, (ii) le niveau de pression médicamenteuse exercée est connu et permet donc d'étudier l'impact de l'utilisation intensive d'antibiotiques sur l'apparition des mutants résistants et sur les transferts de gènes horizontaux entre génotypes.

Les différentes études réalisées dans la littérature ont démontré une structure majoritairement clonale de cette bactérie, mais de nombreuses études suggèrent l'existence de transferts de gènes horizontaux. On ne connaît pas la fréquence de ces échanges, s'ils concernent le génome total ou bien seulement des zones impliquées dans la virulence ou le potentiel de résistance des souches, et quelles sont les conditions environnementales ou de pressions de sélection spécifiques favorisant ces échanges. En effet, l'hypothèse est qu'à chaque environnement les bactéries peuvent adopter une stratégie évolutive spécifique en modulant la fréquence des échanges génétiques et la propagation de clones. Il est donc indispensable d'identifier la dynamique de chaque population responsable des épidémies ou infections nosocomiales. Cette étude se fera de manière prospective afin de suivre l'évolution de Staphylococcus aureus dans le service de réanimation et dans d'autres services du même hôpital. Notre objectif est également de comparer la structure des populations de différents services du CHU de Montpellier avec un service d'un hôpital népalais. Cette étude pourra se faire avec la venue d'un post doctorant népalais (en projet).

Ce projet sera développé par Philippe Corne en collaboration avec Hélène Marchandin rattachée au laboratoire de Bactériologie de l'Hôpital Arnaud de Villeneuve de Montpellier et au Laboratoire de Bactériologie de la Faculté de Pharmacie de Montpellier.

Structure et polymorphisme de facteurs génétiques et phénotypiques des Leishmania impliqués dans l'expression clinique chez l'homme.

Les objectifs spécifiques de ce programme de recherche sont d'étudier des facteurs parasitaires génétiques ou phénotypiques impliqués directement ou indirectement dans les interactions hôtes parasites ou dans le développement de la maladie. Les leishmanioses présentent un grand panel de forme clinique chez l'homme, allant du porteur asymptomatique à une forme viscérale grave, létale sans traitement. Ces facteurs sont donc étudiés en comparant des parasites isolés soit de porteurs asymptomatiques, soit de patients présentant différents niveaux de sévérité de la maladie. Nous avons choisi de travailler d'une part sur des facteurs génétiques impliqués dans les interactions hôtes/parasites et dans l'expression de la pathogénicité, et d'autre part de réaliser une étude protéomique.

Notre projet porte actuellement sur les cystéine protéases (CPB) et les PSA-2 (Promastigote Surface Antigen). Nous avons sélectionné ces deux protéines car elles possèdent une structure génétique particulière : (i) ce sont des gènes multicopies répétés en tandem, (ii) les copies ne sont pas génétiquement identiques avec parfois d'importants polymorphismes et donc donnent la possibilité aux parasites de produire différentes isoformes, (iii) des études montrent que ces copies peuvent être exprimées différentiellement. De plus, il semble que ces protéines soient impliquées dans les processus d'échappement du système immunitaire de l'hôte. Ces différentes données et les premières analyses nucléiques et de sélection positive que nous avons réalisées sur les CPB en particulier, confirment que la structure de ces gènes est importante dans les processus d'évolution, d'adaptation et de survie de ces parasites. Notre hypothèse de travail est que la structure génétique et fonctionnelle de ces protéines correspond à une bibliothèque d'archives de variants antigéniques pour permettre au parasite de s'adapter et d'échapper au système immunitaire de l'hôte. Dans ce contexte, les différentes questions auxquelles nous voulons répondre sont : Est-ce que la production des différentes isoformes est une réponse du parasite à un stimulus externe (système immunitaire de l'hôte)? Est-ce que la production de ces différentes isoformes est aléatoire ? Est-ce que les différences génétiques ou d'expression de ces isoformes peuvent être corrélées avec la pathogénicité observée chez l'homme ? Ce projet est développé par Mallorie Hide, Alain Devault (CR1 CNRS qui souhaite rejoindre notre équipe) et Anne-Laure Bañuls.

Grâce à la plateforme protéomique développée à l'IRD depuis 2 ans et les compétences techniques et théoriques de l'équipe Génétique et génomique du riz, du laboratoire Genetrop, IRD Montpellier, nous avons démarré l'étude du protéome de plusieurs souches de l'espèce Leishmania infantum isolées de patients présentant des formes cliniques différentes. Ce projet est développé par Mallorie Hide et Madhab Lamsal.

Etudes in vitro des interactions intra et inter spécifiques chez les Leishmania

Cette étude expérimentale est réalisée en collaboration avec l'équipe ETE. Les études d'évolution expérimentales permettent d'observer dans des milieux contrôlés les changements phénotypiques qui s'opèrent chez les microorganismes lors d'une modification des conditions environnementales. Ces modifications peuvent être la mise en interactions avec d'autres organismes. Ces études d'évolution expérimentale ont pour but final de mieux comprendre les caractéristiques spécifiques et différentielles de transmission, les pressions de sélection qui peuvent être mises en jeu dans le cas d'interactions telles que les phénomènes de compétition.

Une des questions principales des sciences de l'écologie et de l'évolution porte sur l'évaluation des interactions entre génotypes au sein d'une espèce (intraspécifique) et entre espèces (interspécifique) permettant de définir le succès reproductif des individus dans les populations. Une voie de recherche dans ce domaine est d'analyser le développement des organismes sous différentes conditions expérimentales, cultures mono ou pluri spécifiques in vitro. Les recherches théoriques, naturelles et expérimentales sur les interactions entre hôtes et parasites au sein des populations sont riches dans la littérature scientifique, mais on constate que les études portant sur les interactions entre parasites au sein d'un hôte sont beaucoup moins documentées. De façon caricaturale, les parasites sont tous confrontés au même dilemme: exploiter l'individu hôte pour assurer leur développement sans en provoquer pour autant une mort trop rapide qui compromettrait leur transmission au fil des générations. Des mécanismes de régulation des densités intra hôte sont ainsi connus chez les parasites; ils leur permettent de minimiser l'exploitation tout en préservant leur développement et leur transmission. Ce phénomène est bien connu chez les Leishmanies. Néanmoins, un parasite n'est pas toujours seul au sein d'un hôte : Quelles sont les stratégies à adopter en présence d'un autre parasite conspécifique ou appartenant à une autre espèce ? Les interactions sont elles positives, neutres ou négatives ? Sont elles symétriques ou asymétriques ? Quelles sont alors les " armes moléculaires " mises en jeu lors de ces conflits parasitaires? Les interactions sont elles plus fortes entre parasites sympatriques ou allopatriques ? Existe-t-il des différences en fonction des formes cliniques engendrées par ces parasites? Les formes cliniques viscérales sont-elles plus ou moins agressives que les formes cutanées vis à vis d'un compétiteur ?

Ce travail est développé par Alain Devault, Madhab Lamsal, Mallorie Hide, Anne-Laure Bañuls, François Renaud et en collaboration avec Philip Agnew de l'équipe ETE du laboratoire.